ГОСТ EN 15850-2013 Продукты пищевые. Определение зеараленона в продуктах для детского питания на кукурузной основе, ячменной, кукурузной и пшеничной муке, поленте и продуктах на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста. Метод ВЭЖХ с применением иммуноаффинной колоночной очистки экстракта и флуориметрическим детектированием

     6 Процедура проведения испытания

6.1 Экстракция

6.1.1 Экстракция при испытании ячменной, кукурузной и пшеничной муки, поленты и продуктов для детского питания на кукурузной основе

Измельченную пробу для анализа массой 25 г, измеренной с точностью до 0,1 г, помещают в стакан по 5.11. В стакан добавляют 100 см экстрагента А по 4.14. Содержимое стакана гомогенизируют с использованием гомогенизатора по 5.2 в течение 3 мин при высокой скорости перемешивания, после чего экстракт фильтруют через складчатый фильтр по 5.13.

Отбирают пипеткой по 5.15 аликвоту фильтрата объемом 12 см и помещают ее в коническую колбу по 5.12. В колбу добавляют 88 см фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.10, содержимое колбы тщательно перемешивают. Если при этом раствор в колбе становится мутным, его количественно фильтруют через фильтр из стеклянного микроволокна по 5.14.

6.1.2 Экстракция при испытании продуктов на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста

20 г пробы для анализа, взвешенной с точностью до 0,1 г, помещают в коническую колбу с винтовой крышкой по 5.12. В колбу добавляют 150 см экстрагента В по 4.17, содержимое колбы перемешивают вручную в течение нескольких секунд до получения гомогенной суспензии, после чего встряхивают в течение 1 ч с помощью встряхивателя по 5.5, либо помещают на 15 мин в ультразвуковую баню по 5.23, а затем встряхивают в течение 15 мин с помощью встряхивателя по 5.5.

Экстракт фильтруют через складчатый фильтр по 5.13 в коническую колбу по 5.12 вместимостью 100 см. Аликвоту фильтрата объемом 30 см переносят в мерный цилиндр вместимостью 150 см с пробкой. Объем содержимого в цилиндре доводят до 150 см фосфатно-хлоридным буферным раствором по 4.10. Содержимое цилиндра перемешивают и фильтруют через фильтр из стеклянного микроволокна по 5.14 с помощью вакуумного насоса по 5.21 при неглубоком разрежении. Первые 20 см фильтрата отбрасывают, для дальнейшего анализа отбирают порцию последующего фильтрата объемом около 70 см.

Примечание - При фильтрации экстракта не следует применять глубокое разрежение, поскольку при этом возможно получение мутного фильтрата.

После фильтрации экстракт немедленно подвергают очистке на иммуноаффинной колонке по 6.2.

6.2 Очистка экстракта на иммуноаффинной колонке

Перед кондиционированием колонку выдерживают до достижения ею комнатной температуры. Иммуноаффинную колонку по 4.21 подсоединяют к вакуумному манифолду по 5.17, к верхнему концу колонки присоединяют резервуар для элюента по 5.18.

Колонку кондиционируют путем пропускания через нее 20 см фосфатно-хлоридного буферного раствора по 4.10 со скоростью от 3 до 5 см/мин. Затем в резервуар для элюента вносят 50 см разбавленного и фильтрованного экстракта по 6.1.1 или 6.1.2. Экстракту дают полностью протечь через колонку под действием силы тяжести при постоянной скорости протока до тех пор, пока его уровень не достигнет верхнего фильтра колонки. При прохождении экстракта через колонку скорость протока не должна превышать одну-две капли в секунду.

После прохождения экстракта через колонку ее промывают 20 см воды, или, при испытании продуктов для детского питания, сначала 5 см растворителя для промывания по 4.18, затем 15 см воды со скоростью протока одна-две капли в секунду. По окончании промывания из колонки удаляют воду путем пропускания через нее около 3 см воздуха или азота. Элюат, полученный на стадии промывания колонки, отбрасывают.

Примечания

1 Допускается использовать параметры предварительного кондиционирования и промывания колонки, оговоренные в инструкции по ее применению.

2 При проведении очистки экстракта следует обращать внимание, чтобы сорбционная емкость колонки не была превышена.

6.3 Приготовление раствора пробы для хроматографического анализа

6.3.1 Приготовление раствора пробы для хроматографического анализа при испытании ячменной, кукурузной и пшеничной муки, поленты и продуктов для детского питания на кукурузной основе

Под иммуноаффинную колонку помещают флакон по 5.9 для сбора элюата. В резервуар для элюента по 5.18 пипеткой вносят 1,5 см ацетонитрила по 4.11 и дают ему заполнить колонку. Колонку выдерживают в таком состоянии в течение 1 мин, после чего открывают выход растворителя и элюируют зеараленон со скоростью одна-две капли в секунду. По окончании элюирования для полного выведения из колонки растворителя и сбора всего элюата через колонку пропускают не менее 5 см воздуха.

Элюат выпаривают досуха в токе азота. Остаток после выпаривания растворяют в 1 см дилюента А по 4.15 и тщательно перемешивают с использованием миксера типа Вортекс. Полученный раствор пробы для хроматографического анализа переносят в стеклянный сосуд по 5.9.

В качестве альтернативы раствор пробы для хроматографического анализа готовят разбавлением элюата водой до определенного объема, например 3 см.

6.3.2 Приготовление раствора пробы для хроматографического анализа при испытании продуктов на зерновой основе для питания грудных детей и детей раннего возраста

Под колонку помещают мерную колбу по 5.10 вместимостью 3,0 см для сбора элюата. Через колонку пропускают 0,75 см метанола по 4.12, собирая элюат. Как только весь метанол войдет в колонку, перекрывают выход элюата и выдерживают колонку в контакте с метанолом в течение 1 мин. Затем через колонку пропускают новую порцию метанола объемом 0,75 см, собирая элюат. Для полноты сбора элюата остаток растворителя в колонке аккуратно вытесняют воздухом.

Объем содержимого в мерной колбе с элюатом доводят до метки водой, содержимое колбы перемешивают. В случае образования при разбавлении элюата мутного раствора его фильтруют через мембранный фильтр по 5.22 с помощью пластикового шприца по 5.19.

Примечания

1 При смешивании метанола с водой имеет место уменьшение объема смеси по отношению к сумме объемов каждого ее компонента. Поэтому при необходимости после разбавления элюата водой и перемешивания объем содержимого в мерной колбе повторно доводят до метки водой.

2 Операции очистки экстракта на иммуноаффинной колонке и элюирования зеараленона по 6.3.1 и 6.3.2 допускается проводить с использованием соответствующей автоматизированной системы при соблюдении тех же объемных параметров и скорости протока.

6.4 Приготовление пробы с добавкой зеараленона