ГОСТ 34176-2017 Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности эндо-бета-глюканазы (с Поправкой)

     7 Определение ферментативной активности эндо--глюканазы с использованием бета-глюказима

7.1 Сущность метода

Метод основан на измерении интенсивности окраски красителя, освобожденного в результате гидролиза из субстрата бета-глюказима ферментом эндо--глюканазой, при длине волны 620 нм. Количественное определение степени деградации производят в сравнении с образцом сравнения эндо--глюканазы, имеющим известную активность.

За единицу активности эндо--глюканазы принимают количество фермента, которое действует на -глюкан с высвобождением 1 мкмоля восстанавливающих сахаров (в пересчете на глюкозу).

7.2 Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, материалы и реактивы

Для определения ферментативной активности эндо--глюканазы с использованием бета-глюказима применяют средства измерений, вспомогательные устройства, посуду, материалы и реактивы, которые указаны в 5.2, со следующими дополнениями:

- фотоэлектроколориметр или спектрофотометр любого типа, которые обеспечивают измерения при длинах волн 490-670 нм, с погрешностью измерения коэффициента пропускания не более ±1%, (не более 0,01 единицы оптической плотности);

- шейкер горизонтальный с амплитудой возвратно-поступательного движения 10 мм и диапазоном скоростей от 50 до 250 об/мин;

- шейкер вортексного типа для пробирок с амплитудой встряхивания 3 мм и диапазоном скоростей от 150 до 2500 об/мин;

- кислоту соляную по ГОСТ 3118, х.ч.;

- натрий фосфорнокислый трехзамещенный (тринатрийфосфат) по ГОСТ 201;

- таблетки азурин-структурированного ячменного бета-глюкана (бета-глюказим) в дозировке 60 мг;

- пробирки П-1-15-14/23 ХС с пробками по ГОСТ 1770;

- фильтры обеззоленные "Синяя лента".

7.3 Подготовка к анализу

7.3.1 Приготовление ацетатного буферного раствора молярной концентрации 0,1 моль/дм с кислотностью 4,7 ед. pH

Приготовление ацетатного буферного раствора молярной концентрации 0,1 моль/дм с кислотностью 4,7 ед. pH по 5.3.1.

7.3.2 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм

В мерную колбу вместимостью 100 см вносят примерно 60 см дистиллированной воды, осторожно добавляют 15 см соляной кислоты, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.

7.3.3 Приготовление раствора для торможения реакции (стоп-реагент)

В качестве стоп-реагента используют на выбор один из двух растворов:

1) в мерную колбу вместимостью 1 дм вносят 20 г тринатрийфосфата, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 недели.

2) в коническую колбу вместимостью 500 см вносят 300 см этилового спирта, добавляют 2 см раствора соляной кислоты (см. 7.3.2).

Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 недели.

7.3.4 Приготовление рабочих растворов сравнения эндо--глюканазы

7.3.4.1 Приготовление основного раствора сравнения эндо--глюканазы с известной активностью

В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 1,000 г образца сравнения эндо--глюканазы и приблизительно 70 см ацетатного буферного раствора (см. 5.3.1), полностью растворяют, после чего объем доводят до метки ацетатным буферным раствором и перемешивают.