МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ПРИКАЗ
от 30 октября 2020 года N 655
Об утверждении Методики производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения, используемых для разведения и (или) выращивания на территории Российской Федерации, Методики производства экспертиз (исследований) биологической безопасности генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения, используемых для разведения и (или) выращивания на территории Российской Федерации
В соответствии с пунктом 13 Правил государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы, включая указанную продукцию, ввозимую на территорию Российской Федерации, утвержденных постановлением Правительства Российской Федерации от 23 сентября 2013 г. N 839 (Собрание законодательства Российской Федерации, 2013, N 39, ст.4991),
приказываю:
1. Утвердить:
Методику производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения, используемых для разведения и (или) выращивания на территории Российской Федерации, согласно приложению N 1 к настоящему приказу;
Методику производства экспертиз (исследований) биологической безопасности генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения, используемых для разведения и (или) выращивания на территории Российской Федерации, согласно приложению N 2 к настоящему приказу.
2. Настоящий приказ вступает в силу с 1 марта 2021 г. и действует до 1 марта 2027 г.
Министр
Д.Н.Патрушев
Зарегистрировано
в Министерстве юстиции
Российской Федерации
31 декабря 2020 года,
регистрационный N 62016
Приложение N 1
к приказу Минсельхоза России
от 30 октября 2020 года N 655
Методика производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения, используемых для разведения и (или) выращивания на территории Российской Федерации
1. Настоящая Методика устанавливает порядок проведения молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения, используемых для разведения и (или) выращивания на территории Российской Федерации (далее - исследование, ГММ соответственно).
2. Исследование проводится организацией (испытательной лабораторией), аккредитованной в национальной системе аккредитации в области аккредитации, соответствующей исследованиям, указанным в настоящей Методике.
3. Результаты исследования оформляются заключением о результатах исследования, составляемым на основании протоколов испытаний, которое должно содержать следующие сведения:
наименование заключения;
полное наименование и адрес в пределах места нахождения организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования;
наименование ГММ с указанием его таксономического статуса;
полное наименование, адрес в пределах места нахождения, идентификационный номер налогоплательщика юридического лица, осуществляющего на территории Российской Федерации генно-инженерную деятельность в целях создания ГММ (далее - заявитель);
полное наименование и адрес в пределах места нахождения юридического лица либо фамилия, имя, отчество (при наличии), адрес места жительства индивидуального предпринимателя - изготовителя образцов ГММ, представленных для проведения исследования;
вид предполагаемого целевого использования ГММ;
сведения о трансформационном событии в виде кода, сформированного согласно Общероссийскому классификатору трансформационных событий;
место депонирования и коллекционный номер штамма ГММ (указывается для депонированных ГММ);
регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГММ, предназначенного (предназначенных) для выпуска в окружающую среду, на основе которого (которых) создан ГММ, в отношении которого проведено исследование (в случае если ГММ создан на основе иного (иных) ГММ);
регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГММ для иного целевого использования (при наличии);
сведения о регистрации ГММ за рубежом (при наличии);
оценка полноты представленных заявителем документов и данных;
краткое содержание документов и данных, представленных заявителем для проведения исследования;
описание представленных заявителем для проведения исследования образцов ГММ и исходного микроорганизма-реципиента с указанием их количества, а также оценка их пригодности для проведения исследования;
перечень исследований ГММ с указанием их результатов;
выводы о результатах исследования: о молекулярно-генетической структуре ГММ, об отсутствии или наличии незаявленных генетических конструкций; об эффективности метода идентификации ГММ; сведения о соответствии генетической модификации природным (естественным) процессам;
фамилии, имена, отчества (при наличии) лиц, проводивших исследование, ученые степени, ученые звания (при наличии), места их работы и должности;
дата и номер заключения исследования;
подпись руководителя организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования.
4. К заключению о результатах исследования ГММ должны прилагаться протоколы испытаний, на основании которых оно составлено, подписанные лицами, проводившими исследования.
5. В случае если заявителем не представлены документы и данные, предусмотренные пунктом 6 настоящей Методики, и (или) необходимые образцы, пригодные для проведения исследований, исследование не проводится. Заявителю должен быть выдан мотивированный отказ в проведении исследования, подписанный руководителем организации (испытательной лаборатории), аккредитованной в национальной системе аккредитации в области аккредитации, соответствующей исследованиям, указанным в настоящей Методике, в которую обратился заявитель для проведения исследования.
6. В рамках исследования осуществляется рассмотрение представленных заявителем документов и данных:
а) наименования ГММ с указанием его таксономического статуса; полного наименования и адреса в пределах места нахождения, идентификационного номера налогоплательщика заявителя; полного наименования и адреса в пределах места нахождения юридического лица либо фамилии, имени, отчества (при наличии), адреса места жительства индивидуального предпринимателя - изготовителя образцов ГММ, предоставленных на исследование; вида предполагаемого целевого использования ГММ; регистрационного номера свидетельства о государственной регистрации ГММ, предназначенного (предназначенных) для выпуска в окружающую среду, на основе которого (которых) создан ГММ, в отношении которого проводится исследование (в случае если ГММ создан на основе иного (иных) ГММ); регистрационного номера свидетельства о государственной регистрации ГММ для иного целевого использования (при наличии) либо информации об отсутствии такого свидетельства;
б) сведений об исходном микроорганизме-реципиенте (таксономическая характеристика с указанием метода идентификации; источник выделения штамма: субстрат, географический пункт, дата выделения; методы идентификации штамма, кем идентифицирован (фамилия, имя, отчество (при наличии), ссылка на использованные определители);
в) сведений о трансформационном событии в виде кода, сформированного согласно Общероссийскому классификатору трансформационных событий;
г) информации о месте депонирования и коллекционном номере штамма ГММ, паспорта штамма ГММ (для депонированных штаммов ГММ) либо следующей информации (в случае непредставления информации о месте депонирования и коллекционном номере штамма ГММ, паспорта штамма ГММ):
о культурально-морфологических, физиолого-биохимических (ферментативных), антигенных, биологических свойствах и генетических особенностях штамма ГММ;
об условиях культивирования: наименованиях питательных сред, рН среды, температуре и продолжительности выращивания, сроке хранения и периодичности пересева культуры штамма ГММ в нативной форме;
о применяемом способе и условиях хранения штамма ГММ: в случае лиофилизации указываются продолжительность выращивания на питательной среде (возраст культуры), состав защитной среды, титр клеточной суспензии, режим высушивания, температура хранения, срок хранения; в случае криоконсервации указываются продолжительность выращивания на питательной среде (возраст культуры), состав защитной среды, титр клеточной суспензии, скорость замораживания (град/мин), температура хранения, срок хранения;
о диссоциации культуры в зависимости от метода хранения (описание морфологических типов колоний на конкретной среде с подробным описанием типа, сохраняющего полезный или диагностический признак);
о среде, на которой заявителем предоставляется штамм ГММ;
о количестве, дате приготовления и сроке годности образцов штамма ГММ;
д) описания структуры генетической конструкции (внесенной или удаленной) и места ее локализации, характеристики экспрессии встроенных или измененных генов;
е) информации о генетической модификации (описание метода модификации, структуры вектора, структуры вставки);
ж) информации об организмах - донорах вносимых генов (с указанием группы патогенности при наличии);
з) описания методики, позволяющей идентифицировать генетическую модификацию с описанием нуклеотидных последовательностей, используемых праймеров, зондов и условий полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР);
и) информации о регистрации ГММ за рубежом (при наличии);
к) данных полногеномного секвенирования ГММ (при наличии).
Заявителем для исследования предоставляются образцы ГММ и исходного микроорганизма-реципиента.
7. В рамках исследования должны быть проведены следующие испытания представленных заявителем образцов ГММ и исходного микроорганизма-реципиента:
а) проверка (валидация) методики идентификации ГММ, в том числе оценка чувствительности и специфичности данной методики в соответствии с критериями эффективности, указанными в таблице N 1 приложения к настоящей Методике;
б) подтверждение присутствия (отсутствия) заявленной генетической модификации в геноме ГММ;
в) полногеномное секвенирование ГММ (в случае непредставления заявителем данных полногеномного секвенирования ГММ, проведенного с использованием методики полногеномного секвенирования, соответствующей критериям эффективности, указанным в таблице N 2 приложения к настоящей Методике).
8. Полногеномное секвенирование ГММ проводится с использованием методики полногеномного секвенирования, соответствующей критериям эффективности, указанным в таблице N 2 приложения к настоящей Методике.
Приложение
к Методике производства
молекулярно-генетического
исследования генно-
инженерно-модифицированных
микроорганизмов
сельскохозяйственного
назначения, используемых для
разведения и (или)
выращивания на территории
Российской Федерации,
утвержденной приказом
Минсельхоза России
от 30 октября 2020 года N 655
Таблица N 1
Критерии эффективности методики идентификации ГММ
N | Характеристика | Описание характеристики | Критерий | Методы оценки критерия |
1 | Специфичность ПЦР | Способность ПЦР-тест-системы выявлять только целевую ДНК. | ПЦР-тест-система должна выявлять целевую ДНК. ПЦР-тест-система не должна давать ложноположительных результатов, в том числе выявлять ДНК близкородственных и неродственных биологических видов в 100% проводимых исследований. | Для оценки специфичности используются контрольные панели образцов. В состав панели должны входить образцы, содержащие целевую ДНК и не содержащие целевую ДНК. |
2 | Чувствительность ПЦР | Наименьшее содержание копий целевой ДНК, которое может быть определено с использованием ПЦР-методики, в зависимости от свойств используемых праймеров и зондов | Чувствительность должна быть не ниже 100 копий целевой плазмидной ДНК в одной ПЦР | Проводятся исследования ряда десятикратных разведений целевой плазмидной ДНК с известной концентрацией в двух повторах каждое. Определяется максимальное разведение, при котором ДНК воспроизводимо выявляется (в двух повторах) |
3 | Эффективность ПЦР | Прирост матрицы на каждом цикле амплификации. | Эффективность ПЦР должна быть не ниже 90%. Это соответствует значению наклона линейной области зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК матрицы (slope): не ниже - 3,6 (приемлем диапазон slope 3,1-3,6) | Для оценки эффективности ПЦР проводится амплификация с рядом десятикратных разведений целевой плазмидной ДНК (пункт 2 настоящей таблицы) в двух повторах каждое. По результатам амплификации строится график зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК матрицы. Определяется наклон линейной области (slope). Эффективность ПЦР оценивается по уравнению: Е = [10 (-1/slope)] -1, в идеальном случае - при удвоении количества ПЦР продукта за один цикл: Е = 100%, (slope = -3,32) |
4 | Предел обнаружения ПЦР-тест-системы (LOD) | Минимальное количество биологического искомого объекта в исследуемом образце, которое может достоверно обнаружить данный метод | Чем меньше искомого биологического объекта способен выявить метод, тем выше его чувствительность. Предел обнаружения ПЦР-тест-системы (LOD) должен составлять не более 0,1% | Готовится ряд модельных образцов с разным содержанием целевой матрицы. Готовятся образцы целевого ГММ ингредиента (от 5 до 0,001% содержания) в соответствующей матрице. Приготовленная панель исследуется с использованием ПЦР-методики. Определяется минимальное содержание ГММ-ингредиента в тотальной ДНК организма, при котором ГММ воспроизводимо выявляется (в десяти повторах) |
5 | Предел количественного определения (LOQ) | Наименьшее количество (концентрация) вещества в образце, которое может быть количественно оценено с использованием методики с требуемой правильностью и внутрилабораторной прецизионностью | Предел количественного определения (LOQ) должен быть не более 0,1%. На пределе чувствительности относительное стандартное отклонение (RSD) не должно превышать 20%. Истинное значение измеряемой величины должно входить в полученный при измерениях доверительный интервал | Исследуются 10 повторов 0,1% ГММ-стандарта по ПЦР-методике. Рассчитывается среднее значение содержания ГММ в образце и относительное стандартное отклонение (RSD). Рассчитанное стандартное отклонение (RSD) сравнивается с критерием 20%. Также оценивается, входит ли истинное значение в доверительный интервал полученного среднего значения |
6 | Аналитическая область | Интервал определяемых аналитических характеристик, в котором получаемые результаты имеют приемлемый уровень правильности и прецизионности, приемлем диапазон 0,1-5% | Диапазон 0,1 - 5% ГММ экспериментальных данных должен удовлетворять линейной модели (пункт 7 настоящей таблицы) | Проводятся исследования образцов с различным содержанием ГММ. Оценивается линейность зависимости аналитического сигнала |
7 | Линейность | Наличие линейной зависимости аналитического сигнала в анализируемой пробе в пределах аналитической области методики. Оценивается как коэффициент корреляции R2, определяющий верность модели линейной зависимости Ct от логарифма концентрации калибровочных образцов | Коэффициент R2 для калибровочных образцов должен быть не менее 0,98% | Исследуются в двух повторах 0,1%, 1,0% и 5% калибровочные ГММ-стандарты по ПЦР-методике. Строится калибровочная прямая (dCt от lgC), оценивается коэффициент корреляции данных С линейной зависимостью (R2) |
8 | Правильность | Отклонение среднего результата определений, выполненных с использованием методики, от значения, принимаемого за истинное | Методика дает корректные результаты, если значения, принимаемые за истинные, лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данной методике | Готовятся образцы из калибровочных ГММ-стандартов 0,1%, 1,0% и 5% с добавлением матриц различного происхождения путем смешивания указанных стандартов с другими ингредиентами (сухим молоком, мясным фаршем, рыбной мукой). Образцы исследуются по ПЦР-методике в двух повторах. Оценивается, входит ли истинное значение в диапазон погрешности полученного среднего значения для каждого образца |
Таблица N 2
Критерии эффективности методики полногеномного секвенирования
Этап анализа | Характеристика | Описание характеристики | Критерий |
Подготовка библиотеки для | Концентрация геномной ДНК | Не менее 0,2 нг/мкл | |
секвенирования | Размер фрагментов ДНК | Распределение фрагментов по длинам устанавливается электрофоретически | Распределение в диапазоне 250-1000 п.н. Максимум распределения - 300-500 п.н. |
Проведение массового параллельного секвенирования | Распределение качества идентификации нуклеотидов | Q = -101ogl0p, где р - вероятность неправильного определения нуклеотида | Q > 20, то есть вероятность ошибки не более 0,01 |
Среднее качество прочтения | Q > 25 | ||
Служебные последовательности | Наличие служебных последовательностей (адаптеров* индексов) в прочтении | Должны отсутствовать | |
Покрытие чтения | Число чтений, содержащих определенный нуклеотид последовательности генома | Не менее десятикратного покрытия | |
Представленность нуклеотидов в каждом цикле | Максимальное отклонение между А и Т или G и С | Не более 20% в любой позиции | |
GC-состав на прочтение | Сумма отклонений от ожидаемого распределения | Не более 30% прочтений |
